一种高效微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化

四川大学化工学院制药与生物工程系,成都610065收稿日期: 2005206230修回日期: 2006202220录用日期: 2006202221摘要:从某自来水处理厂的活性污泥中筛选得到了一株稳定高效的微生物絮凝剂产生菌MBF – 33,所产絮凝剂对高岭土悬浮液体系有较好的絮凝作用. 通过培养基优化,对高岭土的絮凝率从81. 3%提高到95%. 实验结果表明: (1)适宜的单一碳源为25 g·L – 1葡萄糖; (2)复合碳源效果优于单一碳源,适宜的复合碳源为蔗糖5 g·L – 1 ,葡萄糖20 g·L – 1 ; (3)无机氮不利于该菌生长,适宜的氮源为单一有机氮,为1. 5 g·L – 1蛋白胨; (4) 0. 2 g·L – 1的MgSO4有利于菌生长,但不利于絮凝剂产生.关键词:筛选;微生物絮凝剂;培养基优化文章编号: 025322468 (2006) 0420584205中图分类号: X172文献标识码: AThe screen ing of a flocculant2produc ing stra in and optim iz ing of its cultureconditionsZHOU L i, ZHANG Yongkui3, CHEN Xiao,L IWanquan, XU ShaoxiaDepartment of Pharmaceutical and Bioengineering, Sichuan University, Chengdu 610065Rece ived 30 June 2005; rece ived in revised form 20 February 2006; accepted 21 February 2006Abstract: A flocculant – p roducing strain MBF233 is isolated. It shows high and stable flocculating activity for Gaoling clay suspension. And itsflocculating activity was higher than other three kinds of flocculants such as PAC and so on. . The flocculating activity could achieve 95% under the bestconditions. The culture condition was op timized and the affection of saltswas studied. The results shows: (1) The best single carbon souce is 25 g·L – 1glucose; (2) Comp lex carbon source is better than single carbon source and the best comp lex carbon source is sucrose 5 g·L – 1 and glucose 20 g·L – 1 ; (3)Inorganic nitrogen could not facilitate growth of the strain, the best nitrogen source is 1. 5 g·L – 1 pep tone; (4) MgSO4 was able to facilitate the growth ofthe strain at 0. 2 g·L – 1 , but restrain the p roduction of flocculant.Keywords: screening; microbial flocculant; culture midium op timizing1前言( Introduction)传统无机及人工合成的有机高分子絮凝剂易引起老年痴呆症(Kurane R et al. , 1991)和具有“三致”效应(Choi et al. , 1998) ,其应用越来越受到限制. 微生物絮凝剂是由微生物菌体分泌的生物高分子物质,是一种新型的天然有机高分子絮凝剂. 因微生物絮凝剂具有产生菌易得、高效、无毒、不会造成二次污染和絮凝范围广泛等优点,日益受到研究者重视. 近年来,国外对微生物絮凝剂作了大量的研究, 筛选得到了几十种微生物絮凝剂, 如Bacillussp. I – 450 (C. GaneshKumar et al. , 2004 ) 、Corynebacterium glutamicum (NingHe et al. , 2002 ) 、Bacillus firmu (H. Salehizadeh et a l. , 2002)等. 其中最具代表性的MBF 是Kurane 利用红平红球菌(Rhodococcus eryth ropolis)研制成功的微生物絮凝剂NOC2l,对泥浆水、河水、粉煤灰水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果( Kurane R eta l. , 1986) ,是目前唯一工业化应用的MBF. 目前微生物絮凝剂研究面临的主要问题是新型微生物絮凝剂产生菌的筛选、培养成本的降低、提高絮凝活性和降低絮凝剂用量.本文拟从活性污泥中筛选出一株活性高用量少的微生物絮凝剂产生菌MBF233,并对其培养条件进行优化以期提高微生物絮凝剂絮凝率.2材料与方法(Materials and methods)2. 1实验材料活性污泥:采自成都自来水厂二次沉淀池.细菌筛选用LB培养基:牛肉膏5 g,蛋白胨10g,NaCl 5 g, H2O 1L, pH为7. 4霉菌筛选用查氏培养基:蔗糖30 g,NaNO3 3 g,K2HPO4 1 g, FeSO4 0. 01 g, KCl 0. 5 g,MgSO4·7H2O0. 5 g, H2O 1 L, pH值自然.放线菌筛选用高氏一号培养基:可溶性淀粉20g, KNO3 3 g, K2HPO4 0. 5 g,MgSO4·7H2O 0. 5 g, FeSO40. 01 g,NaCl 0. 5 g, H2O 1 L, pH为712.2. 2菌种筛选方法将活性污泥稀释并分别接种于上述3种液体培养基中富集培养,然后将菌液稀释10 – 5、10- 6、10- 7倍,在相应培养基的固体琼脂平板上划线,待充分生长后挑取单菌落再次接种于相应的平板培养基纯化,然后分别接种于上述3种液体培养基中进行浅层发酵. 发酵温度30℃,摇床转速为170 r·min- 1 ,发酵时间72h. 发酵完成后取发酵液测其絮凝活性,将具有良好絮凝活性的菌株作为复筛菌种,重复上述步骤多次转接纯化后再进行发酵测定絮凝活性.筛菌流程为:活性污泥富集培养平板划线挑单菌落平板划线纯化摇瓶培养初筛多次纯化及传代培养复筛稳定高絮凝活性菌株.2. 3絮凝活性的评价在100 mL烧杯中配置4 g·L – 1的高岭土悬浊液50 mL (高岭土配置前过160 目筛) , 快速搅拌1min,加入90 mmol·L – 1 CaCl2溶液1 mL,快速搅拌1min,然后加入1 mL发酵液(2. 2节中的复筛菌株发酵液)搅拌0. 5 min,静置10 min,小心取上清液测OD550 ,记为B. 同上用空白样操作,不加入发酵液,OD550值记为A ,则絮凝率按下式计算:η = (A – B ) ×100 /A.菌浓度的测定用光电比浊计数法(沈萍等,1996).2. 4培养基优化采用单因素实验,分别改变培养基中碳源种类及其浓度、氮源种类及其浓度、无机盐的种类和初始pH值,测量发酵液的絮凝率与菌浓度以找出较适宜的培养基组成. 发酵在50mL摇瓶中完成,装液量为摇瓶标定容量的20% ,将已培养10h的菌种以10%的接种量接入,然后在30℃, 170～180 r·min- 1的摇床上培养72h. 具体实验条件如下.碳源种类的选择:分别采用25 g·L – 1的葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖、取代LB 培养基中的碳源蛋白胨,其余培养条件不变,实验比较得出较适宜的碳源.碳源浓度的选择:得出适宜碳源后改变碳源浓度为5、25、55、85和145g·L – 1 ,其余培养条件不变.得出较适宜的碳源浓度.复合碳源的选择:采用碳源C1、C2、C3、C4、C5作为LB培养基的碳源,其余培养条件不变. 以得出复合碳源对菌种生长和发酵的影响. 其中C1为蔗糖25g·L- 1 ; C2为蔗糖20 g·L – 1 ,葡萄糖5 g·L – 1 ; C3为蔗糖12. 5 g·L – 1 ,葡萄糖12. 5 g·L – 1 ; C4 为蔗糖5g·L- 1 , 葡萄糖20 g·L – 1 ; C5为葡萄糖25 g·L- 1.氮源种类的选择:分别采用3 g·L – 1蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、大豆饼粉、玉米粉、KNO3、尿素和(NH4 ) 2 SO4取代牛肉膏作为LB培养基的氮源,碳源采用已实验得出的较适宜的碳源,其余培养条件不变. 得出较适宜的氮源.氮源浓度的选择:改变氮源浓度为0. 5 、1. 5、215 、3. 5 和4. 5g·L – 1 ,其余培养条件不变. 实验比较得出较适宜的氮源浓度.复合氮源的选择:采用蛋白胨+不同种类的无机氮组成复合氮源,其余培养条件不变,得到复合氮源对菌种生长和发酵的影响. 氮源N1为蛋白胨+NH4 Cl,N2为蛋白胨+ (NH4 ) 2 SO4 ,N3为蛋白胨+尿素, N4 为蛋白胨+ KNO3 , N5 为空白样,采用215 g·L – 1蛋白胨. N1、N2、N3、N4中蛋白胨浓度均为0. 5 g·L – 1 ,无机氮浓度均为2 g·L – 1.无机盐的选择:分别在培养基中加入0. 2g·L – 1的NaCl、KNO3、(NH4 ) 2 SO4、MgSO4和CaCl2 ,其余培养条件不变,得到不同无机盐对菌种生长或产物发酵的影响.pH值的选择: 分别改变培养基初始pH 值为415、5. 5、6. 5、7. 5、8. 5和9. 5,其余培养条件不变,得到较适宜的初始pH值.2. 5与几种常见絮凝剂絮凝效果的比较为比较微生物絮凝剂与目前常用絮凝剂的絮凝效果,把目前常用的絮凝剂PAC、PFC和聚合硫酸铝配成一定浓度的溶液,在高岭土悬浊液中各加入1 mL,并调节pH 为7 ～8, 测定其对高岭土的絮凝率.5852. 6絮凝剂粗品提取将发酵液在10000 r·min- 1下离心5 min,将上清液取出, 加入1. 2 倍体积的乙醇, 在10000r·min- 1下离心5 min,取出沉淀用60%乙醇洗涤2次,冷冻干燥即得MBF233粗品.3结果(Results)3. 1菌种筛选从活性污泥中筛选出83株菌,有絮凝活性的有12株,经过多次传代培养和纯化,得到一株分离自LB培养基中并有稳定絮凝活性的菌株MBF – 33.该菌在LB培养基中对高岭土悬浊液的絮凝率达到81. 3% ,絮体大,沉降速度快. 该菌株菌苔呈,表面光滑粘稠,在600倍显微镜下观察为短杆状.3. 2碳源种类的选择不同碳源条件下实验结果见表1. 从絮凝活性看,葡萄糖和蔗糖为碳源时菌种有较高的絮凝活性,淀粉和乳糖为碳源时絮凝活性较低;从菌种生长来看,葡萄糖最容易被利用,蔗糖、淀粉和乳糖不太容易被利用,不能被利用. 有研究表明,某些菌株胞外多糖水解酶较少,故单糖比多糖更容易被利用(沈萍,2000). 实验结果表明,对于MBF233,葡萄糖更容易被利用同时利于絮凝剂产生. 与用葡萄糖相比,用蔗糖时菌浓度低得多,而絮凝率只是略低. 可见蔗糖不太容易被该菌利用,有利于在发酵液中保持较高的碳源浓度,故蔗糖可以作为长效碳源.表1碳源种类的选择 Table 1 The choice of carbon sources 碳源种类絮凝率菌数/ (108 CFU·mL -1 ) 葡萄糖83. 3% 4. 85 淀粉72. 0% 2. 52 乳糖78. 3% 2. 89 蔗糖80. 6% 2. 30 0 0 3. 3碳源浓度的选择不同碳源浓度下实验结果见图1. 从絮凝率来看,以25 g·L – 1的葡萄糖作为碳源时,菌株对高岭土絮凝率最高,达到最高86. 8%;从菌种生长来看,以25 g·L – 1的葡萄糖作为碳源时菌浓度最高,过高或过低的糖浓度都不利于该菌株生长. 这是由于糖浓度过低不能提供足够的能量和物质来源;而糖浓度过高一方面会引起发酵液中渗透压过高,使细胞失水,生长受到抑制,另一方面糖浓度过高使代谢产生的葡糖酸增加,发酵液pH值降低,不利于菌株生长. 对MBF233而言, 25 g·L – 1的糖浓度为最佳浓度. 图1葡萄糖浓度对絮凝的影响Fig. 1Effect of glucose concentration on flocculating activity3. 4复合碳源的选择由于葡萄糖有利于细胞的生长,蔗糖可以作为长效碳源,所以选用这两者搭配为复合碳源. 实验结果见图2. 图2复合碳源对絮凝的影响Fig. 2Effect of comp lex carbon source on flocculating activity由图2可知与单一的葡萄糖和蔗糖相比,复合碳源能有效的提高絮凝率和菌浓度. 随着C葡萄糖/C蔗糖增加,菌浓度和絮凝率随之增加, 20 g·L – 1的葡萄糖和5 g·L – 1的蔗糖组成的复合碳源得到最高的絮凝率和菌浓度. 而胞外产物的积累通常需要培养基中碳源过量,单一的速效碳源会很快被消耗,单一的长效碳源又不能得到理想的初始细胞浓度,两者都无法得到较高的产物产率. C葡萄糖/C蔗糖= 1 /4时絮凝率与菌浓度较高,证明在此条件下既能得到较好的细胞浓度,又能保持培养基中碳源过量,故能取得较好的效果.3. 5氮源种类的选择采用不同种类氮源的实验结果见表2. 由表知在几种无机氮源中菌无法正常生长,表明该菌可能还需要某种只有有机氮源才有的生长因子或微量元素. 在几种有机氮源中蛋白胨能得到最高的絮凝率和菌浓度,为最佳氮源. 若应用于工业生产,便宜易得的大豆饼粉可以替代蛋白胨作为氮源.表2氮源种类的选择 Table 2 The choice of nitrogen sources 氮源种类絮凝率菌浓度/ (108 CFU·mL -1 ) 蛋白胨94. 3% 5. 77 酵母浸膏76. 0% 3. 56 牛肉浸膏84. 0% 5. 21 大豆饼粉91. 7% 5. 70 玉米粉63. 8% 5. 77 KNO3 0 0 尿素0 0 (NH4 ) 2 SO4 0 0 3. 6氮源浓度的选择不同氮源浓度下实验结果见图3. 由图3可知,从絮凝率来看,以1. 5 g·L – 1蛋白胨为氮源时,所得菌株对高岭土有最好的絮凝率. 这是因为浓度过高导致C /N比降低,不利于产物积累;浓度过低不能得到理想的菌浓度,同样不利于絮凝剂产生. 从菌浓度来看,随着氮源浓度升高,菌浓度增加,可见高浓度的氮源有利于菌种生长. 氮源浓度超过3. 5g·L – 1时,菌浓度增加不多,表明此时氮源已不是生长的瓶颈. 所以对产物发酵而言1. 5 g·L – 1蛋白胨较合适;对种子培养基,考虑到成本因素3. 5 g·L – 1蛋白胨较合适. 图3氮源用量的确定Fig. 3The choice of nitrogen concentration3. 7复合氮源的选择采用不同复合氮源时实验结果见表3. 由表可知对于该菌种,采用复合氮源无论是絮凝活性还是菌浓度都远远低于采用蛋白胨作为单一氮源的空白样,故该菌种并不适合采用复合氮源培养.表3复合氮源的选择 Table3 The choice of comp lex nitrogen sources 氮源絮凝率菌浓度/ (108 CFU·mL -1 ) N1 58. 4% 1. 92 N2 58. 1% 2. 42 N3 38. 1% 2. 46 N4 51. 6% 2. 10 N5 92. 5% 6. 80 3. 8无机盐的选择在培养基中加入不同种类无机盐时实验结果见表4. 与不加入无机盐作生长因子的空白样相比,这5种无机盐都对絮凝剂的产生有少量抑制作用;NaCl、KNO3 和CaCl2 对菌生长无明显影响,(NH4 ) 2 SO4和MgSO4对菌的生长有较好的促进作用. 可能是由于这2种无机盐能提供SO2 -4 ,而SO2 -4为菌细胞内合成含硫氨基酸或某种维生素所必需(沈萍, 2000) ,故有利于该菌生长. 综合上述实验结果,种子培养基中宜加入0. 2 g·L – 1的MgSO4.表4无机盐种类的选择 Table4 The choice of salts 无机盐 絮凝率菌浓度/ (108 CFU·mL -1 ) NaCl 82. 0% 5. 54 KNO384. 0%5. 22 (NH4 )2SO4 80. 0% 9. 79 MgSO481.0% 10. 6CaCl2 82. 5% 5. 43 空白 95. 3% 5. 91 3. 9pH值的选择不同初始pH条件下实验结果见图4. 由图4知生长最适pH值在7. 5左右, pH值太高或太低均不利于该菌生长. 这是由于一方面pH值过低或过高都会引起微生物表面电荷的改变,从而不利于细胞对营养物质的吸收;另一方面pH值的改变会让有机化合物离子化,不利于有机化合物渗入细胞(郑怀礼, 2004). 对于絮凝剂的产生,最适pH值为515,此时絮凝率高达95%. 这是由于该菌产物略呈酸性,初始pH 值为5. 5 时在发酵72 h 后pH 值为512,二者pH值相近,故利于产物产生;而pH过高或过低则会对产物生成有不同程度的抑制. 在此基础上可以推测,若在对数生长期末期之前控制pH为7. 5将利于菌株的生长,在平稳期即产物的产生时期将pH值控制在5. 5将利于产物的产生,可以达到更大的絮凝剂产率.由图5知在72 h发酵后发酵液的pH值与初始 图4 pH值对絮凝率的影响Fig. 4The affection of pH on flocculationpH值相比都有不同程度的降低,初始pH值越高降低越多. 这是由于一方面代谢过程中葡糖酸的增加导致pH值下降,另一方面该菌代谢产物为酸性多糖(絮凝剂粗品溶于与发酵液等量的水pH≈ 5. 3) ,故pH值有不同程度的下降. 图5 72h发酵后pH值Fig. 5The pH value after 72 hours’fermentation 3. 10与几种常见絮凝剂絮凝效果的比较实验结果如图6所示. 在絮凝剂浓度小于40 mg·L – 1范围内,微生物絮凝剂的絮凝率明显高于絮凝剂;当浓度超过40 mg·L- 1时,微生物絮凝剂的絮凝效果急剧下降;当浓度超过50 mg·L – 1时聚合硫酸铝絮凝能力显著提高,聚合氯化铝也有一定提高;而聚 图6不同絮凝剂絮凝效果比较Fig. 6Comparison of various kinds of flocculant丙烯酰胺的絮凝率始终较低. 可见微生物絮凝剂絮凝率更高,而且达到较高絮凝率时用量较少,同时不会造成污染,比絮凝剂有较大优势.4结论(Conclusions)1)从活性污泥种筛选出一株高效絮凝剂产生菌株,在最佳发酵培养基中絮凝率达95%. 2)实验得到较适宜的种子培养基为蔗糖5 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3. 5g、K2HPO4 2 g、MgSO4 0. 2 g、H2O 1L、pH 7. 5;适宜的发酵培养基为蔗糖5g、葡萄糖20g、蛋白胨1. 5 g、K2HPO42g、H2O 1 L、pH 5. 5. 3)与目前常见絮凝剂相比,微生物絮凝剂具有用量少、絮凝率高的特点.通讯作者简介:张永奎, (1966 – ) ,男,四川大学化学工程学院教授(博士). 主要研究方向为微生物胞外聚合物、生物冶金与生物脱硫. E2mail: zhangyongkuimail@163. com, Tel: 028- 85408255References:C. GaneshKumar, Han2SeungJoo, Jang2WonChoi, et al. 2004. Purificationand characterization of an extracellular polysaccharide Fromhaloalkalophilic B acillus sp. I2450 [ J ]. Enzyme and MicrobialTechnology, 34: 673—681Choi C W, Yoo S A, Oh I H, et al. 1998. Characterization of anextracellula flocculating substance p roduced by a p lanktoniccyanobacterium Anabaena sp [ J ]. Biotech Lett, 20 (7) : 643—646H Salehizadeh, S A Shojaosadati. 2002. Isolation and characterization of abioflocculant p roducedby B acillus firm us [ J ]. BiotechnologyLetters, 24: 35—40Kurane R,Nohata Y. 1991. Microbail flocculation of waste water liquidsand oil Emulsion by a bioflocculant from Alcaligenes latus [ J ].Agric Biol Chem, 55 (4) : 1127—1129Kurane R, Toeda K, Takeda K, et al. 1986. Culture Conditions forProduction of Microbial Flocculant by Rhodococcus erythropolis[ J ]. Agic Biol Chem, 50 (9) : 2309—2313Ma F, Li S G. 2002. 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